Биоинформатическое исследование антимикробных пептидов, выявленных в мухе Черная львинка

Антимикробные пептиды (AMП) играют ключевую роль в врожденном иммунитете, первой линии защиты от бактерий, грибков и вирусов. AMП представляют собой небольшие молекулы, в диапазоне от 10 до 100 аминокислотных остатков, продуцируемых всеми живыми организмами. Из-за их широкого биоразнообразия насекомые являются одними из самых богатых и инновационных источников для AMП.

В частности, насекомое Hermetia illucens (Черная Львинка) демонстрирует необычайную способность жить во враждебных средах, так как питается разлагающимися субстратами, которые богаты микробными колониями, и является одним из наиболее перспективных источников для AMП. Были исследованы личинки и комбинированные взрослые самцы и самки транскриптомов H. illucens, и все последовательности, мнимо кодирующие AMП, были проанализированы с помощью различных алгоритмов машинного обучения, таких как машина опорных векторов, дискриминантный анализ, искусственная нейронная сеть и случайный массив, доступный в базе данных CAMП, чтобы предсказать их антимикробную активность.

Кроме того, инструмент iACP, AVPpred и серверы Antifp использовались для прогнозирования противоопухолевой, противовирусной и противогрибковой активности соответственно. Соответствующие физико-химические свойства оценивались с помощью калькулятора и предиктора базы данных антимикробных пептидов. Эти анализы позволили идентифицировать 57 мнимо активных пептидов, подходящих для последующих экспериментальных валидационных исследований.

Знакомство

Имея более чем один миллион описанных видов, насекомые представляют собой самый разнообразный, а также самый большой класс организмов в мире, благодаря их способности адаптироваться к повторяющимся изменениям и их устойчивости к широкому спектру патогенов.

Их иммунная система, основанная исключительно на врожденном, хорошо развитом иммунном ответе, позволяет осуществлять общий и быстрый ответ на различные вторгшиеся организмы. Гуморальный иммунный ответ включает ферментативный каскад, который регулирует активацию коагуляции и меланизации гемолимфы, производство активных видов кислорода (АФК) и азота (RNS) и производство антимикробных пептидов (AMП).

Сегодня проблема устойчивости к антибиотикам представляет собой одну из самых больших угроз в медицинской сфере. Постоянная потребность в поиске альтернативных решений со временем повысила интерес к АМП.

AMП представляют собой небольшие молекулы, состоящие из 10-100 аминокислот, которые были идентифицированы во многих организмах, таких как бактерии, грибы, растения, позвоночные и беспозвоночные, включая насекомых. Это катионные молекулы, которые проявляют активность против бактерий, грибков, вирусов и паразитов. В дополнение к этим известным действиям, многие пептиды также оказывают цитотоксическое действие против раковых клеток.

Открытие первого AMП, полученного из насекомых, датируется 1980-ми годами, когда Boman et al. идентифицировал и выделил первый цекропин из чешуекрылого Hyalophora cecropia. С тех пор было обнаружено много других AMП. Из-за их высокого биоразнообразия насекомые считаются одними из самых богатых и инновационных источников этих молекул.

AMП насекомых можно классифицировать на четыре семейства:

• α-спиральные пептиды (например, цекропины)
• богатые цистеином пептиды (например, дефензины)
• богатые пролинами пептиды
• богатые глицином пептиды

Несмотря на свое разнообразие, AMП имеют две общие черты: тенденцию к принятию амфипатической конформации и наличие большого количества основных остатков, которые определяют чистый положительный заряд при нейтральном рН. Установленные электростатические силы между положительными аминокислотными остатками пептида и отрицательными зарядами, выставленными на клеточные поверхности микроорганизмов, позволяют им взаимодействовать с бактериальными мембранами.

Кроме того, катионная природа этих пептидов позволяет взаимодействовать с отрицательно заряженными молекулами, выставленными на поверхности раковых клеток, такими как фосфолипидный фосфатидилсерин (PS), O-гликозилированные муцины, сиалилированные ганглиозиды и гепарин сульфат, в отличие от типичной цвиттерионной природы нормальных мембран млекопитающих.

В соответствии с их механизмом действия, AMП могут быть сгруппированы в две категории:

1. механизм мембранолитика, описанный тремя различными предполагаемыми моделями: «ковровой», «тороидальной» и «бочкообразной» моделью
2. немембранолитический механизм, характеризуемый их прямым взаимодействием с внутриклеточными мишенями, такими как ДНК, РНК и белки

На сегодняшний день было обнаружено более 3000 AMП и сообщено в Antimicrobial Peptide Database (APD, https://aps.unmc.edu/AP/),которая содержит ровно 3104 AMП из шести царств:

• 343 от бактерий
• 5 от архей
• 8 от протистов
• 20 от грибов
• 349 от растений
• 2301 от животных

Количество AMП у насекомых варьируется в зависимости от вида, т.е. более 50 AMП было обнаружено у инвазивной божьей коровки Harmonia axyridis, в то время как ни один из них не был идентифицирован в гороховой тлей Acyrthosiphon pisum.

Не являющаяся насекомым-вредителем Hermetia illucens (Черная Львинка), также известная как «Черная солдатская муха», является одним из наиболее перспективных источников для AMП, способных жить во враждебной среде, богатой микробными колониями.

В этом исследовании мы проанализировали личинки и комбинированны транскриптомы взрослых самцов и самок H. illucens , чтобы идентифицировать AMП, которые затем были проанализированы с базой данных CAMP (Collection of Antimicrobial Peptides)(https://www.cAMП.bicnirrh.res.in/). Кроме того, онлайн-инструмент iACP(https://lin.uestc.edu.cn/server/iACP) использовался для прогнозирования противоопухолевой активности идентифицированных пептидов, в то время как сервер AVPpred(https://crdd.osdd.net/servers/avppred) использовался для прогнозирования противовирусной активности идентифицированных пептидов, в то время как сервер Antifp(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/antifp ) использовались для прогнозирования их противогрибковой активности, а их физико-химические свойства оценивались с помощью калькулятора и предиктора базы данных антимикробных пептидов (APD3).

Результаты

De novo сборка транскриптома и идентификация генов

Секвенирование следующего поколения (RNAseq) РНК, выделенной из личинок и комбинированных взрослых самцов и самок транскриптомов H. illucens, было выполнено для однозначной идентификации кандидатов в пептиды.

Секвенирование и сборка de novo транскриптомов привели к идентификации 25 197 уникальных нуклеотидных последовательностей (contigs) в транскриптоме личинок и 78 763 контигов у объединенных взрослых особей. Эти контиги были функционально аннотированы с помощью программного обеспечения Blast2GO (https://www.blast2go.org). В общей сложности 68 генов, кодирующих мнимые AMП в транскриптомах H. illucens, были окончательно идентифицированы.

Прогнозирование противомикробной, противоопухолевой, противовирусной и противогрибковой активности

Все идентифицированные 68 последовательностей, кодирующих предполагаемое AMП, были проанализированы in silico четырьмя алгоритмами машинного обучения, такими как Support Vector Machine (SVM), Discriminant Analysis (DA), Artificial Neural Network (ANN) и Random Forest (RF), доступными в бесплатной онлайн-базе данных CAMП, чтобы предсказать их антимикробную активность.

Результаты приведены в таблице 1. В таблице 2 приведены противоопухолевые и неопухолевые показатели, полученные с помощью инструмента iACP. В таблице 3 приведены результаты, полученные с помощью сервера AVPpred для прогнозирования противовирусной активности и с помощью сервера Antifp, используемого для прогнозирования противогрибковой активности.

Эти анализы позволили идентифицировать 57 предполагаемых активных пептидов:

• 13 последовательностей, по прогнозам, были только противомикробными, в то время как другие показали различные комбинации противомикробной, противовирусной, противоопухолевой или противогрибковой активности
• 22 из них были как предполагаемыми противомикробными, так и противоопухолевыми
• 8 из них были как предполагаемыми противомикробными, так и противовирусными
• 2 из них были как предполагаемыми противомикробными, так и противогрибковыми
• 7 из них были предполагаемыми противомикробными, противоопухолевыми и противовирусными
• 1 из них являет предполагаемое противомикробное, противогрибковое и противовирусное действие
• 2 из них были предполагаемыми противоопухолевыми и противогрибковыми
• 2 потенциально охватывают весь спектр анализируемой биологической активности (противомикробная, противоопухолевая, противогрибковая и противовирусная).
• Остальные 11 не проявили никакой активности в соответствии с расследованием in silico. В дополнительной таблице S1 перечислены все прогнозируемые виды деятельности.

Таблица 1. Прогнозирование антимикробной активности через базу данных CAMР.

Таблица 2. Прогнозирование противоопухолевой активности с помощью инструмента iACP.

Таблица 3. Результаты, полученные с помощью сервера AVPpred для прогнозирования противовирусной активности и с сервера Antifp для прогнозирования противогрибковой активности.

Физико-химические свойства идентифицированных пептидов

57 идентифицированных, предположительно активных пептидов принадлежат к различным классам AMП, включая дефензины, цекропины, аттацины и лизоцим (рис. 1). Хотя аттацины и лизоцим являются белками из-за их высокой молекулярной массы, они принадлежат к классам AMП из-за их антибактериальной активности.

Физико-химические свойства этих пептидов оценивали с помощью калькулятора базы данных антимикробных пептидов и предиктора APD3 (таблица 4). На рис. 2 показано графическое представление рассчитанных физико-химических свойств 57 идентифицированных пептидов, тогда как в таблице 5 сообщается об их аминокислотном составе и частоте аминокислот по сравнению с аминокислотным составом патентных АМП, доступных в базе данных APD.

Самое высокое содержание аминокислот во всех проанализированных АМП было обнаружено для остатков Gly, Ala, Arg, Asn, Cys, Leu, Ser, тогда как самое низкое содержание было обнаружено для остатков His, Met, Trp, Tyr (таблица 5). Графическое представление аминокислотного состава каждого идентифицированного пептида показано на дополнительном рисунке 1. 

Молекулярная масса идентифицированных пептидов колеблется от 3000 Да для наименьшего пептидного Hill_BB_C7985 до 19 000 Да для самого большого пептидного Hill_BB_C9237, в среднем около 7000 Да. Аминокислотные последовательности варьировались от минимального значения 31 остатка до максимума 186 остатков и в среднем приблизительно 66 остатков. Общее гидрофобное соотношение показало наименьшее значение 26 для пептидного NHill_AD_C53857 и самое высокое из 60 для пептидного Hill_BB_C390, а среднее значение приблизительно 40. Общий чистый заряд идентифицированных пептидов варьировался от −6 для Hill_BB_C390 пептида до +9 для Hill_BB_C14202 пептида со средним значением +3, в то время как изоэлектрическая точка (pI) варьировалась от 3,34 для Hill_BB_C390 пептида до 11,83 для NHill_AD_C12928 пептида со средним значением 8,79.

Рисунок 1.

Рисунок 1. Графическое изображение идентифицированных классов AMП из личинок и взрослых транскриптомов. Круговая диаграмма показывает, что наибольшее количество идентифицированных пептидов относится к классу дефенсинов.

Таблица 4. Прогнозирование физико-химических свойств с использованием калькулятора и предиктора базы данных антимикробных пептидов (APD3) и инструмента Compute pI/Mw — Expasy.

Рисунок 2.

Рисунок 2. Графическое представление физико-химических свойств 57 пептидов с предполагаемой активностью: (a) общее гидрофобное соотношение; (b) общий чистый заряд; (c) изоэлектрическая точка; (d) молекулярный вес; (e) длина пептида; (f) индекс Бомана.

Таблица 5 Аминокислотная частота и аминокислотный состав идентифицированных пептидов.

Рост и жизнеспособность бактериальных клеток

Были выбраны и химически синтезированы четыре предполагаемых антимикробных пептида, а именно Hill_BB_C6571, Hill_BB_C16634, Hill_BB_C46948 и Hill_BB_C7985, которые показали высокие значения антимикробных показателей со всеми программными обеспечениями прогнозирования.

Антимикробная активность этих пептидов была проверена путем мониторинга роста клеток E. coli в присутствии различных концентраций каждого пептида по сравнению с необработанными клетками. На рисунке 2 показаны кривые роста клеток E. coli в присутствии 3 мкМ (А) или 12 мкМ (В) концентраций каждого пептида. Явное снижение кривых роста наблюдалось при обеих концентрациях по сравнению с необработанными клетками (синяя линия) с бактериями, ослабленными для достижения экспоненциальной фазы при 12 мкМ из-за быстрой смерти. Снижение жизнеспособности клеток наблюдалось при увеличении концентрации каждого пептида по сравнению с необработанными клетками.

Далее, жизнеспособность клеток E. coli также оценивали путем лечения 3 мкМ каждого пептида (дополнительный рис. 2С), подтверждая снижение жизнеспособности клеток примерно на 50% после 100 мин лечения всеми четырьмя проанализированными пептидами.

Обсуждение

AMP являются многообещающими кандидатами в качестве альтернативы обычным антибиотикам благодаря их низкой токсичности для эукариотических клеток и их широкому спектру действия против бактерий, микобактерий, грибков, вирусов и раковых клеток.

AMP могут убивать бактерии с помощью различных механизмов, включая разрушение мембраны, нацеливание на внутриклеточные компоненты или вмешательство в бактериальный метаболизм. Кроме того, большинство АМП являются катионными, с положительным чистым зарядом, способствующим электростатическому взаимодействию с отрицательно заряженными бактериальными мембранами.

Все живые организмы производят AMP, причем насекомые являются одними из самых богатых источников из-за их высокого биоразнообразия и чрезвычайно разнообразной среды обитания. Иммунная система насекомого H. illucens очень развита, так как этот вид питается разлагающимися субстратами и навозом, которые чрезвычайно богаты патогенными микроорганизмами, что можно наблюдать и у других видов, например, у Eristalis tenax. 

Двадцать два AMP действительно были идентифицированы в Diptera E. tenax, который смог адаптироваться к различным водным средам обитания (канализационные резервуары и навозные ямы) с большой микробной нагрузкой. AMP, которые синтезируются жировым телом и гемоцитами, а затем секретируются в гемолимфу, являются неотъемлемой частью иммунной защиты. В этом исследовании мы сосредоточились на генном уровне, чтобы идентифицировать все предполагаемые гены, кодирующие AMP

Рисунок 3.

Рисунок 3. Стратегии, проводимые с целью выявления пептидов из Hermetia illucens insect.

Транскриптомы личинок H. illucens, а также комбинированных взрослых самцов и самок были собраны, и все полученные контиги были функционально аннотированы с помощью программного обеспечения Blast2Go, что привело к идентификации 68 предполагаемого пептида, представляющих интерес.

Эти последовательности были проанализированы in silico через базу данных CAMP и онлайн-инструмент iACP для оценки их антимикробной и противораковой активности соответственно. Кроме того, серверы AVPpred и Antifp использовались для прогнозирования противовирусной и противогрибковой активности идентифицированных пептидов, соответственно.

Наши результаты привели к выявлению 57 пептидов, 13 из которых были предположительно наделенные антимикробной активностью, 22 с противомикробной и противоопухолевой активностью, восемь с антимикробной и противовирусной активностью, два с антимикробной и противогрибковой активностью, семь с противомикробной, противоопухолевой и противовирусной активностью (Дополнительная таблица S1). ).

Только один пептид был прогнозирован с антимикробной, противовирусной и противогрибковой активностью, в то время как два пептида предполагали антимикробную, противоопухолевую и противогрибковую активность (Дополнительная таблица S1). Удивительно, но два пептида, соответствующие Hill_LB_C16634 и NHill_AD_C69719 контигам, дали положительный результат для всех прогнозов активности (дополнительная таблица S1). 

Большинство выявленных пептидов относятся к семействам дефенсинов и цекропинов, состав которых колеблется от 34 до 51 аминокислоты.Эти пептиды имеют рисунок из шести цистеинов, которые участвуют в образовании трех дисульфидных связей, Cys1-Cys4, Cys2-Cys5 и Cys3-Cys6, для дефенсинов насекомых.

Дефензины насекомых активны против грамотрицательных бактерий, таких как Escherichia coli, но в основном против грамположительных бактерий, таких как Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Aerococcus viridians и Bacillus megaterium. Кроме того, некоторые дефенины насекомых также активны против грибков.

Например, пептид роялизина, выделенный из маточного молочка Apis mellifera, состоит из 51 аминокислоты, а 6 остатков цистеина участвуют в образовании трех дисульфидных связей и активны против грамположительных бактерий и грибов.

Мишени дефензина еще не идентифицированы, и исследования взаимосвязи структура-активность могут быть полезны для понимания молекулярного механизма, лежащего в основе их биологической активности.

Цекропины были впервые получены от моли H. cecropia и представляют собой наиболее распространенное семейство линейных α-спиральных AMП у насекомых, активных против грамотрицательных и грамположительных бактерий.

Насекомыми цекропинами, в основном полученными из видов чешуекрылых и диптеран, являются цекропины A, B и D. Они состоят из 35-37 аминокислот без остатков цистеина и способны лизировать бактериальную мембрану и уменьшать поглощение пролина. Например, цекропин В, линейный катионный пептид, состоящий из 35 аминокислот, снижает летальность нагрузки E. coli и уровень эндотоксинов в плазме, а также проявляет противогрибковую активность в отношении Candida albicans.

 Кроме того, из слюнных желез самки комара Aedes egyptiбыл выделен цекропиноподобный пептид, проявляющий противовирусную активность против вируса лихорадки денге. Остаток глицина является наиболее распространенным среди пептидов, которые мы идентифицировали, и особенно связан с белками аттацина.

Хотя механизм действия различных AMП еще не полностью выяснен, похоже, что AMП, в отличие от антибиотиков, испытывают больше трудностей в возникновении микробной резистентности, и большинство из них не разрушают нормальные клетки высших животных. Недавно было продемонстрировано, что пептид клаваспирина из оболочки Styela clava проявляет способность убивать лекарственно-устойчивые патогены, такие как S. aureus, без обнаруживаемой резистентности.

Кроме того, было продемонстрировано, что два богатых пролином пептида (Lser-PRP2 и Lser-PRP3) не мешают синтезу белка, но оба способны связывать бактериальный шаперон DnaK и, следовательно, способны ингибировать сворачивание белка. Характеристики АМП делают их отличными кандидатами для разработки новых препаратов.

Биоинформационный подход представляет собой мощный инструмент для прогнозирования физико-химических свойств и предполагаемой функции аминокислотных последовательностей. Тем не менее, мы стремились выйти за рамки простой функциональной аннотации, которая обычно опирается исключительно на сходство последовательностей с пептидами, депонируемыми в общедоступных базах данных.

Действительно, подход, о котором мы сообщили, основан на использовании нескольких программ, ранее используемых для выполнения аналогичного анализа, которые используют различные алгоритмы для определения оценки, которая предсказывает биологическую активность неизвестных пептидов.

Мы продемонстрировали, что подобный подход может обеспечить надежные указания о потенциальной биологической активности потенциальных АМП, что подтверждается нашими предварительными испытаниями на антимикробную активность четырех идентифицированных АМП (дополнительный рис. 2). 

Тем не менее, валидационные исследования были вне рамок этого исследования, которое было по существу направлено на выявление набора пептидов-кандидатов, которые могли бы служить отправной точкой для последующей функциональной характеристики H. illucens AMП нашей группой, а также другими исследователями в этой области. 

Действительно, после анализа in silico крупнейшие пептиды могут быть получены с помощью рекомбинантных методологий, в то время как химический синтез может быть использован для более мелких. Структурный анализ может быть выполнен с помощью масс-спектрометрии и кругового дихроизма (CD), а биологическая активность может быть оценена с помощью тестов in vitro.

Произведенные пептиды, по сути, могут быть протестированы in vitro, чтобы подтвердить их активность против различных бактериальных штаммов, как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий, линий раковых клеток и грибов. Кроме того, пептиды, проявляющие интересную биологическую активность, могут быть получены в слиянии с подходящими метками для исследования их механизма действия с помощью экспериментов функциональной протеомики и передовых методологий масс-спектрометрии, чтобы охарактеризовать их взаимодействие с целевым белком (главным образом компонентами биологических мембран), тем самым идентифицируя возможные белковые мишени.

Материалы и методы

Выращивание Hermetia illucens  и выделение РНК

Личинки Hermetia illucens выращивались на разных диетах, чтобы свести к минимуму возможное влияние конкретного субстрата на экспрессию пептидов, согласно протоколу, принятому Vogel et al. Взрослых особей выращивали в экологической камере в контролируемых условиях: температура 27 ± 1,0 °C, влажность 70% ± 5% и фотопериод 12:12 ч [L:D]. Поскольку неясно, все ли АМП выражены одинаковым образом в разных личинках, РНК была получена из двух разных звезд, чтобы определить максимальное количество экспрессированных АМП.

Таким образом, с помощью реагента TRI в соответствии с инструкциями производителя (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) РНК извлекали из всего организма взрослых и из двух личинок стадий: 2и и 5й личинки instar, чья изолированная РНК впоследствии была объединена в соотношении 1:1 для RNAseq.

Для устранения любой загрязняющей ДНК была проведена обработка ДНКазы (Turbo DNase, Ambion Austin, Texas, США). После удаления фермента ДНКазы РНК дополнительно очищали с помощью RNeasy MinElute Clean Up Kit (Qiagen, Venlo, Нидерланды) в соответствии с протоколом производителя и элюировали в 20 мкл раствора для хранения РНК (Ambion Austin, Texas, США).

Целостность РНК была проверена на биоанализаторе Agilent 2100 с использованием чипов РНК Nano (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), а количество РНК определяли спектрофотометром Nanodrop ND1000.

RNA-Seq, de novo личинки и комбинированные сборка и идентификация генов взрослых самцов и самок

Секвенирование транскриптома всех образцов РНК проводили с поли(А) + обогащенной мРНК, фрагментированной в среднем до 150 нуклеотидов. Секвенирование проводилось Центром генома Макса Планка (https://mpgc.mpipz.mpg.de/home/) с использованием стандартных процедур TruSeq на секвенсоре Illumina HiSeq2500. Сборка транскриптома de novo проводилась с использованием CLC Genomics Workbench v7.1 (https://www.clcbio.com), который предназначен для сборки больших транскриптомов с использованием последовательностей из платформ секвенирования с коротким чтением.

Все полученные последовательности (contigs) использовались в качестве запросов для поиска BLASTX  без резервирования (nr) в базе данных «Национального центра биотехнологической информации» (NCBI), учитывая все обращения с отсечкой значения E 10–5. Транскриптомы были аннотированы с помощью поиска BLAST, Gene Ontology и InterProScan с помощью Blast2GO PRO v2.6.1 (https://www.blast2go.de).

Для оптимизации аннотации полученных данных был использован GO slim, подмножество терминов GO, которое обеспечивает более высокий уровень аннотаций и позволяет более глобально рассматривать результат. Гены-кандидаты AMП были идентифицированы с помощью установленного эталонного набора AMП и лизоцимов, полученных от насекомых, и дополнительных этапов фильтрации, чтобы избежать интерпретации неполных генов или аллельных вариантов в качестве дополнительных генов AMП.

Анализ in silico для прогнозирования противомикробной, противоопухолевой, противовирусной и противогрибковой активности

Последовательности, функционально аннотированные программным обеспечением Blast2Go как антимикробные пептиды, были проанализированы с помощью Prop 1.0 и Signal  P 4.0 (серверы для идентификации сигнального пептида и пропептидной области).

Зрелые и активные пептидные области были проанализированы in silico с помощью четырех алгоритмов машинного обучения, доступных в базе данных CAMП.: Машина опорных векторов (SVM), дискриминантный анализ (DA), искусственная нейронная сеть (ANN) и случайная выборка (RF) для прогнозирования их антимикробной активности. Минимальный расчетный порог для последовательности, чтобы считаться антимикробной, составляет 0,5.

Когда все последовательности были проанализированы с помощью алгоритмов, те, которые получили оценку выше 0,5, автоматически считались программным обеспечением предполагаемыми противомикробными препаратами.

Мы хотели бы отметить, что порог устанавливается программным обеспечением и не может быть изменен пользователем. Это верно для алгоритмов SVM, RF и DA, которые сообщают о результате в числовой форме (оценка), в то время как алгоритм ANN предоставляет результаты в виде категорий, а именно либо AMП (антимикробный), либо N/AMП (не антимикробный).

Все последовательности, которые показали положительный результат при всех четырех статистических методах, рассматривались как антимикробные. Инструмент iACP использовался для прогнозирования противоопухолевой активности тех же последовательностей, предоставляя результаты в числовом виде. Прогнозирование противовирусной активности проводилось in silico с помощью онлайн-сервера AVPpred. Он использует четыре различные модели:

1. рисунок AVP, который возвращает результат как ДА или НЕТ
2. модель выравнивания, которая дает результат в виде AVP или Non-AVP
3. композиционная модель
4. физико-химическая модель, которые возвращают свои результаты в числовой форме (в процентах).

Общий результат выражается ДА, если результаты пептидов обладают предполагаемой противовирусной активностью, и НЕТ, если иначе. Сервер Antifp использовался для прогнозирования противогрибковой активности и выдает результат в виде числовой оценки. Для этого анализа использовался порог 0,5.

Оценка физико-химических свойств

Соответствующие физико-химические свойства идентифицированных предполагаемого активного пептида после анализа in silico, такие как длина пептида, молекулярная масса, общее гидрофобное соотношение, общий чистый заряд, изоэлектрическая точка и индекс Бомана, были определены калькулятором и предиктором базы данных антимикробных пептидов (APD3) и инструмент Compute pI/Mw — Expasy.

Рост и жизнеспособность бактериальных клеток

Были выбраны и химически синтезированы четыре предполагаемого антимикробного пептида, а именно Hill_BB_C6571, Hill_BB_C16634, Hill_BB_C46948 и Hill_BB_C7985, которые показали высокие значения антимикробных показателей со всеми программными обеспечениями прогнозирования (Bio-Fab Research, Рим, Италия). Клетки E. coli инкубировали в течение ночи в среде LB при 37 °C. Затем культуру разбавляли до концентрации 0,08 OD.600/мл в свежей среде и выращенный при 37 °C в течение 90 мин. При значении OD/ml 0,5 антимикробные пептиды добавляли в культуру в конечной концентрации 3 или 12 мкМ. Рост культуры оценивали каждые 20 мин в течение в общей сложности 120 мин путем оценки абсорбирования при 600 нм.

Жизнеспособность клеток оценивали путем перечисления колониеобразующих единиц (КОЕ) после 16 ч инкубации с 3 мкМ каждого пептида. Серийные разведения бактериальных культур до концентрации 10–6 были подготовлены клетки как для обработанных, так и для необработанных образцов. Наконец, 100 мкл каждого образца покрыли агаром LB каждые 20 минут в общей сложности 100 минут. Пластины инкубировали в течение 16 ч при 37 °C, а затем подсчитывали КОЕ, встречающиеся на каждой пластине. Эксперименты проводились в трех экземплярах.

Ссылка на оригинал статьи (англ. язык)
A bioinformatic study of antimicrobial peptides identified in the Black Soldier Fly (BSF) Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae) [В Интернете] / авт. A. Moretta, R. Salvia, C. Scieuzo, et al. // Journal Citation Reports® . - https://www.nature.com/articles/s41598-020-74017-9#citeas.